液相色譜分析以經(jīng)典的液相色譜為基礎，是以高壓下的液體為流動相的色譜過程。通常所說的柱層析、薄層層析或紙層析就是經(jīng)典的液相色譜。所用的固定相為大于100um 的吸附劑（ 硅膠、氧化鋁等）。這種傳統(tǒng)的液相色譜分析所用的固定相粒度大，傳質擴散慢，因而柱效低，分離能力差，只能進行簡單混合物的分離。而液相色譜分析所用的固定相粒度小（5um-10um）、傳質快、柱效高。液相色譜分析是20世紀60年代后期發(fā)展起來的一種分析方法。近年來，在保健食品功效成分、營養(yǎng)強化劑、維生素類、蛋白質的分離測定等應用廣泛。世界上約有80%的有機化合物可以用HPLC來分析測定。

　　液相色譜分析原理

　?。ㄒ唬┮合嗌V分析的流程 折疊

　　液相色譜分析由泵將儲液瓶中的溶劑吸入色譜系統(tǒng)，然后輸出，經(jīng)流量與壓力測量之后，導入進樣器。被測物由進樣器注入，并隨流動相通過色譜柱，在柱上進行分離后進入檢測器，檢測信號由數(shù)據(jù)處理設備采集與處理，并記錄色譜圖。廢液流入廢液瓶。遇到復雜的混合物分離（極性范圍比較寬）還可用梯度控制器作梯度洗脫。這和氣相色譜的程序升溫類似，不同的是氣相色譜改變溫度，

　　而ＨＰＬＣ改變的是流動相極性，使樣品各組分在*條件下得以分離。

　?。ǘ┮合嗌V分析的分離過程

　　液相色譜分析同其他色譜過程一樣，ＨＰＬＣ也是溶質在固定相和流動相之間進行的一種連續(xù)多次交換過程。它借溶質在兩相間分配系數(shù)、親和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差別使不同溶質得以分離。

　　開始樣品加在柱頭上，假設樣品中含有３個組分，Ａ、Ｂ和Ｃ，隨流動相一起進入色譜柱，開始在固定相和流動相之間進行分配。分配系數(shù)小的組分Ａ不易被固定相阻留，較早地流出色譜柱。分配系數(shù)大的組分Ｃ 在固定相上滯留時間長，較晚流出色譜柱。組分Ｂ的分配系數(shù)介于Ａ，Ｃ之間，第二個流出色譜柱。若一個含有多個組分的混合物進入系統(tǒng)，則混合物中各組分按其在兩相間分配系數(shù)的不同先后流出色譜柱，達到分離之目的。

　　不同組分在色譜過程中的分離情況，首先取決于各組分在兩相間的分配系數(shù)、吸附能力、親和力等是否有差異，這是熱力學平衡問題，也是分離的首要條件。其次，當不同組分在色譜柱中運動時，譜帶隨柱長展寬，分離情況與兩相之間的擴散系數(shù)、固定相粒度的大小、柱的填充情況以及流動相的流速等有關。液相色譜分析所以分離zui終效果則是熱力學與動力學兩方面的綜合效益。

　　液相色譜儀的操作步驟如下：

　　1. 過濾流動相，根據(jù)需要選擇不同的濾膜。

　　2. 對抽濾后的流動相進行超聲脫氣10-20分鐘。

　　3. 打開HPLC工作站（包括計算機軟件和色譜儀），連接好流動相管道，連接檢測系統(tǒng)。

　　4進入HPLC控制界面主菜單，點擊manual，進入手動菜單。

　　5. 有一段時間沒用，或者換了新的流動相，需要先沖洗泵和進樣閥。沖洗泵，直接在泵的出水口，用針頭抽取。沖洗進樣閥，需要在manual菜單下，先點擊purge，再點擊start，沖洗時速度不要超過10?ml/min。

　　6. 調(diào)節(jié)流量，初次使用新的流動相，可以先試一下壓力，流速越大，壓力越大，一般不要超過2000。點擊injure，選用合適的流速，點擊on，走基線，觀察基線的情況。

　　7. 設計走樣方法。點擊file，選取select?users?and?methods，可以選取現(xiàn)有的各種走樣方法。若需建立一個新的方法，點擊new?method。選取需要的配件，包括進樣閥，泵，檢測器等，根據(jù)需要而不同。選完后，點擊protocol。一個完整的走樣方法需要包括：a.進樣前的穩(wěn)流，一般2-5分鐘；b.基線歸零；c.進樣閥的loading-inject轉換；d.走樣時間，隨不同的樣品而不同。

　　8. 進樣和進樣后操作。選定走樣方法，點擊start。進樣，所有的樣品均需過濾。方法走完后，點擊postrun，可記錄數(shù)據(jù)和做標記等。全部樣品走完后，液相色譜分析再用上面的方法走一段基線，洗掉剩余物。

　　9 關機時，先關計算機，再關液相色譜